2025, 45(7): 696-701.
摘要
目的 探讨移植解冻后2~4 h未扩张囊胚对临床妊娠和新生儿结局的影响。
方法 采用回顾性队列研究，分析2015年1月至2024年3月在中国人民解放军联勤保障部队第九〇一医院生殖医学中心进行的 2 428个玻璃化冻融单囊胚移植周期的临床资料。根据解冻后2~4 h囊胚腔是否扩张，将110个未扩张囊胚移植周期设为A组，2 318个扩张囊胚移植周期设为B组。通过1∶1倾向性评分匹配后，A组与B组各109个周期，比较两组的妊娠及新生儿结局。
结果 倾向性匹配前，两组的优质囊胚移植率、4期扩张囊胚移植率、不孕原因中子宫内膜异位症及其他占比差异均有统计学意义（均P<0.05）。经倾向性评分匹配后，两组的基础资料相比差异均无统计学意义（均P>0.05）。A组的临床妊娠率［27.52%（30/109）］、持续妊娠率［21.10%（23/109）］及活产率［19.27% （21/109）］显著低于B组［61.47%（67/109）、51.38%（56/109）、47.70%（52/109）］，差异均具有统计学意义（均 P<0.001）。新生儿结局显示，两组的出生体质量、新生儿体长、畸形率、单卵双胎率及男孩出生率差异均无统计学意义（均P>0.05）。
结论 移植解冻后未扩张囊胚可能降低临床妊娠率，但对新生儿结局无显著负面影响。
【关键词】体外受精；囊胚移植；玻璃化作用；再扩张；倾向性评分匹配
基金项目：中国人民解放军联勤保障部队第九〇一医院院管重点课题（2023YGZD06）
DOI：10.3760/cma.j.cn101441-20250207-00050
囊胚培养作为体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer， IVF-ET）中的一项常规技术，已在临床中广泛应用。囊胚移植能在减少移植胚胎数量的同时维持较高的临床妊娠率和活产率，尤其在高龄患者群体中展现出显著优势［1］。此外，囊胚移植有助于改善胚胎与子宫内膜的同步性，降低胚胎非整倍体率，显著提高胚胎种植率［2］。随着囊胚培养技术的普及，冻融囊胚周期的数量也相应增加。研究显示，冻融囊胚周期的妊娠及新生儿结局甚至可能超过新鲜周期［3-4］。
尽管玻璃化冷冻技术已显著提升了囊胚的复苏存活率，但荟萃分析表明，仍有1%~5%的囊胚在复苏后出现退化现象［5］。目前，判断复苏囊胚存活的主要依据包括细胞损伤比例以及复苏培养后囊腔的再扩张能力［6-7］。然而，由于囊胚细胞数量多且分布分散，准确评估细胞损伤比例存在较大挑战。囊胚腔的形成依赖于细胞膜Na+、K+转运的离子梯度差，而囊胚腔状态的维持由滋养外胚层细胞（trophectoderm， TE）的完整性决定，因此，部分学者倾向于将囊腔的再扩张能力视为胚胎存活的关键指标［8］，甚至据此丢弃复苏后未扩张的囊胚或再次解冻胚胎合并移植［9-10］。然而，囊胚的发育及孵出过程涉及囊胚腔的反复扩张-收缩，单个时间点对囊胚腔的评估可能存在误判［11］。目前，关于解冻后囊胚腔未扩张的研究报道少见，因此，本研究分析了复苏2~4 h后未扩张囊胚的妊娠结局及对新生儿的影响，旨在评估解冻后未扩张囊胚的潜在利用价值。
资料与方法
1.研究对象与分组：采用回顾性队列研究，分析2015年1月至2024年3月在中国人民解放军联勤保障部队第九〇一医院生殖医学中心接受玻璃化冻融单囊胚移植的临床资料。根据囊胚解冻后培养2~4 h囊胚腔是否扩张，将未扩张囊胚移植周期设为A组，将扩张囊胚移植周期设为B组。纳入标准：①单囊胚解冻移植；②囊胚复苏后无退化趋势（退化细胞呈分散状，膜边界不清或大部分细胞暗黑成团聚集）。排除标准：①未经治疗的输卵管积水或宫腔积液；②宫腔粘连；③黏膜下肌瘤或子宫内膜息肉；④严重的子宫内膜异位症等影响胚胎着床的因素。本研究已获得中国人民解放军联勤保障部队第九〇一医院伦理委员会批准（伦理号：LY2023YGZD06），严格遵守《赫尔辛基宣言》的基本原则。因本研究为回顾性分析，本院伦理委员会已豁免患者签署知情同意书。
2.促排卵方案及IVF操作：促排卵方案及IVF操作参照我们之前的报道［12］，主导方案包括拮抗剂方案和标准长方案。促排卵过程中依据卵泡的发育速度及雌二醇、黄体生成素的水平调整促性腺激素剂量，当至少3个卵泡直径达17 mm时，于当晚肌内注射重组人绒毛膜促性腺激素（艾泽，德国Merck公司）250 µg扳机，36~38 h后穿刺取卵。根据精子的质量实施常规IVF授精或卵胞质内单精子注射。根据Gardner等［13］提出的囊胚评分标准，本研究对囊胚进行形态学评估。具体标准如下：将3BB及以上的囊胚定义为优质囊胚；若内细胞团或TE任一评分为C级，则定义为非优质囊胚；CC级囊胚不纳入统计分析。在本研究中，所有胚胎的形态学评分至少由两名实验室人员共同完成，以确保评分的准确性和一致性。
- 囊胚的玻璃化冷冻及解冻：囊胚玻璃化冷冻及解冻程序遵循厂家的操作说明（日本Kitazato公司）进行。具体步骤如下：囊胚冷冻，对囊胚行激光破膜15~20 min，待囊胚腔完全塌陷，将其放入含7.5%乙二醇和7.5%二甲基亚砜的平衡液中8~10 min，随后转移至含15%乙二醇、15% 二甲基亚砜和0.5 mol/L蔗糖的玻璃化液中1 min，最后将囊胚装入冷冻载体（Cryotop，日本Kitazato公司），立即浸入液氮。囊胚解冻，将囊胚从液氮迅速转移到37 ℃含1 mol/L蔗糖溶液约1 min，然后将胚胎转移到0.5 mol/L蔗糖稀释液中室温解冻3 min，再用洗涤液洗涤胚胎2次，每次5 min。最后将胚胎转移到G-2PLUS培养基（瑞典Vitrolife公司）中，移至倒置显微镜下观察拍照并用激光对囊胚透明带进行削薄，胚胎培养2~4 h后再次观察并记录囊腔扩张情况。移植无退化趋势或明显冷冻损伤（细胞内无明显片状发暗或折光性消失）的胚胎。移植后35 d，B超检查显示胎心搏动及宫内孕囊为临床妊娠。
- 评估囊腔扩张等级：基于本中心标准操作程序规定，根据囊胚腔内扩张面积及透明带与滋养细胞的间隙面积（即未扩展面积），将囊腔扩张等级分为5级。A级为囊腔扩张80%~100%或孵出 （完全扩张）；B级为囊腔扩张60%~79%；C级为囊腔扩张30%~59%；D级为囊腔扩张<30%；E级为囊腔扩张接近0%（未扩张）。鉴于囊腔扩张等级评估存在一定的主观性，为减少偏差，本研究仅统计囊腔扩张（包括A、B、C及D级）和未扩张（E级）的数据，以减少主观偏差。
5.观察指标：主要观察指标包括临床妊娠率、流产率、持续妊娠率及活产率；次要观察指标包括异位妊娠率、早产分娩率及过期分娩率。临床妊娠定义为超声观察到孕囊或胎心，包括宫内、宫外及宫内外同时妊娠，两个或以上孕囊记为1例临床妊娠。持续妊娠定义为妊娠超过12周。异位妊娠定义为孕囊着床位置不在子宫腔内。流产定义为妊娠28周内发生自然流产。活产定义为每移植周期至少获得1例活产分娩。早产定义为妊娠满28周不足37周的分娩。过期分娩定义为妊娠超过42周的分娩。相关计算公式如下：临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%，持续妊娠率=持续妊娠周期数/移植周期数×100%，异位妊娠率=异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%，流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%，活产率=活产周期数/移植周期数×100%，早产率=早产周期数/活产周期数×100%，过期分娩率=过期分娩周期数/活产周期数×100%。
- 统计学方法：采用SPSS26.0统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，并通过两独立样本t检验进行比较。计数资料采用率或构成比（%）表示，组间比较采用χ2检验或连续性修正及Fisher’s精确概率法检验。倾向性评分匹配（propensity score matching，PSM）：将囊胚腔是否扩张设为因变量（囊腔未扩张：Y=1，囊腔扩张，Y=0），将女方年龄、体质量指数、不孕年限、基础卵泡刺激素水平、抗苗勒管激素水平、子宫内膜厚度、不孕原因、内膜准备方案、囊胚质量、第5天（day 5，D5）囊胚移植率设为协变量纳入模型，通过logistic回归计算PSM分值，匹配过程中采用了1∶1的邻近匹配法，设卡钳值为0.02，以未扩张囊胚组为基准进行匹配。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
本研究共纳入2 428个囊胚移植周期，其中包括A组110个未扩张囊胚移植周期，B组2 318个扩张囊胚移植周期，经PSM后，A组与B组各109个周期。
- 两组基础资料的比较：PSM前，A组与B组分别在不孕原因中子宫内膜异位症和其他病因占比、优质囊胚移植率、4期囊胚移植率及D5囊胚移植率差异均有统计学意义（均P<0.05）。PSM后，A和B两组的基础资料相比差异均无统计学意义（均P>0.05，表1）。
- 两组临床结局的比较：PSM前，A组的临床妊娠率、持续妊娠率和活产率分别显著低于B组，而异位妊娠率、流产率、分娩胎龄、早产率及过期分娩率组间比较差异均无统计学意义（均P>0.05）。PSM后，A组和B组分别在临床妊娠率、持续妊娠率和活产率组间比较差异均有统计学意义（均P<0.001），其他差异均无统计学意义（均P>0.05，表2）。
- 两组新生儿结果的比较：PSM前后，两组的新生儿出生体质量、新生儿体长、畸形儿率、单卵双胎率、男孩占比差异均无统计学意义（均P>0.05，表3）。
讨论
玻璃化冷冻技术因其安全、简便及高效的特点，已成为胚胎冷冻保存的首选方法。尽管玻璃化冻融技术已广泛应用于辅助生殖领域，但囊胚复苏存活的评判标准尚存争议［10，14］。胚胎的存活能力主要取决于其组成细胞对低温及冷冻保护剂的耐受性。此外，由于扩张囊胚内充满大量囊胚液，会显著降低玻璃化冷冻的速率，并增加冰晶形成的风险。因此，在冷冻前需去除囊胚腔内的液体。研究表明，在玻璃化冷冻前对囊胚进行人工皱缩处理，可以有效减少囊胚腔内的液体量，从而降低冷冻过程中的低温损伤风险。这种处理方式不仅显著提高了复苏后囊胚的存活率，并能改善临床妊娠率［15］。目前，判断囊胚复苏存活通常基于两个条件：一是复苏后存活细胞的比例，二是囊胚腔是否在复苏后重新扩张。理论上，复苏后存活的胚胎会继续进行有丝分裂，从而较易识别“活”胚胎。然而，由于囊胚结构复杂且细胞分布密集，难以像分裂期胚胎直接观察到退化细胞的比例及细胞增殖情况。有研究报道，复苏后未扩张的囊胚常伴随严重的冷冻损伤，这可能是导致囊胚腔不能再扩张的原因之一［16］。因此，部分学者以复苏后囊胚腔是否重新扩张作为胚胎存活的评判标准［17］。
本研究探讨了复苏培养后未扩张囊胚与扩张囊胚的临床及新生儿结局差异，研究结果显示，复苏后2~4 h囊胚腔发生再扩张的囊胚，其临床妊娠率、持续妊娠率和活产率均显著高于未扩张囊胚。然而，值得注意的是，完全皱缩的囊胚仍有可接受的临床妊娠率（27.52%）和活产率（19.27%），且流产率并未显著增加。这一结果表明，单纯因囊胚腔未扩张而取消移植周期的做法并不可取。此外，复苏后培养时间的差异也可能是导致临床结果不一致的潜在因素［18］。囊胚的发育过程常伴有囊胚腔的反复收缩和扩张，这是胚胎孵化的重要步骤。如观察时恰逢囊胚处于收缩阶段，则可能造成对囊胚腔扩张结果的误判。Giunco等［11］通过测量囊胚腔在解冻后至移植前的直径变化（即移植前囊腔直径减去解冻后直径），显示无论移植前囊胚腔扩张数值为正值（扩张）还是负值（收缩），均对临床妊娠率无显著影响。此外，实时观察系统的研究表明，部分未扩张的胚胎在复苏5 h后能恢复囊胚腔并发育至孵化阶段［19］。这些发现提示，囊胚腔未扩张并不等同于胚胎发育潜能的完全丧失，决策上应综合考虑多种因素，而非单一指标。
目前，囊胚腔未扩张的确切机制尚未完全阐明。有学者认为囊胚腔的形成及囊胚液的积聚主要受Na+/K+ATP酶调控的跨滋养层细胞离子梯度差的影响［20-21］。复苏囊胚腔再扩张与新鲜囊胚的囊胚腔扩张机制相似。复苏后，存活的滋养层细胞能够重新建立紧密连接并封闭囊胚腔。随后，滋养层细胞通过主动转运钠离子，形成胚胎内外的离子梯度差，导致渗透压失衡，水分被动流入囊胚腔，促使囊胚腔再次扩张。这一过程不仅体现了滋养层细胞的功能完整性，也反映了胚胎在复苏后的代谢活性和发育潜力。当复苏后囊胚腔扩张失败或延迟，提示滋养层细胞在冷冻-复苏过程中可能受到损伤，导致其失去了细胞间封闭的能力。Gardner等［22］研究显示，复苏后扩张的囊胚在葡萄糖和丙酮酸的吸收以及乳酸的产生量上均显著高于未扩张的囊胚，这表明未扩张的囊胚可能在冻融过程中受到损伤，丧失细胞代谢功能。因此，囊胚腔的再扩张能力不仅反映了滋养层细胞的存活状态，还可能作为评估胚胎冷冻-复苏后发育潜力的重要指标。另外，女方高龄、胚胎质量差或发育慢是影响冷冻囊胚再次扩张的因素［23］。Ito等［14］ 研究证实，年龄≥35岁（OR=0.901，95% CI：0.871~0.931）、非优质囊胚（OR=0.388，95% CI：0.268~0.561）及第6天囊胚（OR=0.363，95% CI：0.187~0.704）是影响临床妊娠的独立因素。而高龄、低质量胚胎及胚胎发育缓慢通常与胚胎非整倍体率的增加相关。Chen等［24］的研究进一步揭示胚胎的染色体与囊胚扩张程度、内细胞团及滋养外胚层形态具有相关性。基于这些发现，推测未扩张囊胚可能伴随较高的非整倍体率，其或许是导致种植潜力低下的另一因素。此外，本研究中未扩张囊胚样本的年度分布存在不均衡现象（早期样本量较少），推测可能与当时的移植策略有关。由于早期对未扩张囊胚的妊娠结局缺乏了解，我们采取了较为审慎的移植策略。例如，当患者剩余胚胎数量较多，或未扩张囊胚的评级较差时，我们会与患者充分沟通，并根据具体情况选择放弃移植或进行双胚胎移植。
在新生儿结局方面，本研究结果显示，未扩张囊胚组与扩张囊胚组在出生体质量、体长、畸形儿率、单卵双胎率及男孩占比等指标差异均无统计学意义，这提示未扩张囊胚临床应用的安全性。然而，本研究设计存在一定局限性，因未采用胚胎实时观察技术来记录胚胎的动态发育过程，这使得我们无法判断观测囊胚腔的皱缩状态是持续存在，还是经历了扩张与再皱缩的循环。有学者建议，若胚胎在移植前未显示再次扩张迹象，将培养时间延长至5 h有利于准确评估胚胎的存活状态［19］。然而，也有学者通过对比囊胚复苏后不同培养时间认为，培养3~4 h已足以评估囊胚复苏结果，且延长培养时间对临床结局无显著影响［25］。
综上所述，复苏后2~4 h未扩张囊胚的临床妊娠率、持续妊娠率和活产率显著低于扩张囊胚，但未扩张囊胚仍具有种植潜能，且对出生的新生儿无明显不良影响。对于高龄、卵巢低反应及囊胚形成率较低的患者，未扩张囊胚仍具有重要的利用价值。因此，当复苏的未扩张囊胚没有显示明显的冷冻损伤及退化趋势，我们建议不要轻易丢弃，应在充分告知患者并下调期望值的前提下，考虑使用这些胚胎，或让患者根据自身情况做出选择。这一策略不仅有助于提高胚胎利用率，也为部分患者带来更多的妊娠机会。
